浅谈丹参酮ⅡA对心肌细胞损伤的修复作用的分析论文
1 材料
1.1 动物出生1～3 d雄性Wistar大鼠，SPF级，购自南方医科大学实验动物中心，合格证号SCXK粤-20060015。
1.2 药品与试剂
胎牛血清购自杭州四季青生物工程研究所；胰蛋白酶、DMEM培养基购于Gibico公司；丹参酮ⅡA购于中国药品生物制品检定所（批号110766-200417）；乳酸脱氢酶（LDH）测定试剂盒、丙二醛（MDA）测定试剂盒、超氧化物歧化酶（SOD）测定试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、过氧化氢酶（CAT）测定试剂盒、总抗氧化能力（T-AOC）测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所；AnnexinV-FITC细胞凋亡检测试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司。
2 方法
2.1 分组原代乳鼠心肌细胞经分离、纯化后进行实验分组，分为以下几组：①正常组：培养的正常心肌细胞培养；②模型组：心肌细胞培养液中添加200 μmol/L H2O2作用2 h；③丹参酮ⅡA高剂量组：心肌细胞用丹参酮ⅡA 1×10-4mol/L培养24h后添加200 μmol/L H2O2继续作用2 h。④丹参酮ⅡA中剂量组：心肌细胞用丹参酮ⅡA 5×10-5mol/L培养24 h后添加200 μmol/L H2O2继续作用2 h。⑤丹参酮ⅡA低剂量组：心肌细胞用丹参酮ⅡA 1×10-5mol/L培养24 h后添加200 μmol/L H2O2继续作用2 h。
2.2 新生大鼠心肌细胞培养参照Goldenberg等［4］方法略加改进。取出生1～3 d SD乳鼠，在75％酒精中浸泡8s后取出，固定四肢。用无菌眼科剪剪开胸部，无菌眼科弯镊取出心脏。迅速将心脏放入装有冷D-Hanks液的培养皿中，去除心房及心外膜的结缔组织，将心室剪开，洗净残血，反复洗3次。将心室肌在无菌培养皿侧壁剪碎成1～2 mm3的小组织块。将小组织块移入50 ml塑料离心管中，加入0.1％胰蛋白酶5ml，37℃消化6 min。自然沉淀后去除第1次上清，再加入5 ml胰蛋白酶于37℃消化6 min后，轻轻吹打，自然沉淀后，取上清移入15 ml离心管中，加含血清培养基终止消化，1 000 r/min离心10 min，洗两次。剩余沉淀继续加胰蛋白酶消化，如此反复消化7～10次直至组织块完全消化。将离心所得沉淀用含15％胎牛血清的培养基制成细胞悬液，在CO2培养箱中差速贴壁1 h，去除非心肌细胞（主要是成纤维细胞和内皮细胞）。1 h后轻轻吸出细胞悬液，调整细胞密度，将心肌细胞悬液均匀接种于6孔板内，置于二氧化碳培养箱中培养。前48 h加入终浓度为0.1 mmol/L的5-溴脱氧尿苷，每24 h换液1次。
2.3 心肌细胞活力检测 采用MTT比色法测定心肌细胞活力。心肌细胞悬液以1.5×104/ml接种于96孔板。分组处理后，每孔加入20 μl MTT（5 mg/ml），在培养箱中37℃孵育4 h。吸去上清，每孔加入DMSO 150 μl。微孔振荡器上振荡10 min。酶标仪检测570 nm波长的吸光度值。每孔OD值减去空白孔OD值为测试孔OD值。活细胞数与OD值成正比。每组每个时间点设6个复孔，取其平均值。
2.4 心肌细胞凋亡吸出培养液，D-Hanks洗细胞3次，5 min/次。向培养瓶中加入2～3 ml 0.125％胰蛋白酶（使用前应预热至37℃左右），镜下观察细胞，待其变圆，细胞间分离但尚未脱落时倒去胰酶，加入原培养液终止消化，吹打瓶壁，使细胞脱落。将细胞悬液转移至离心管，1 000 r/min 离心5 min，加PBS重悬细胞，调整细胞浓度为1×106/ml，取0.5 ml上述细胞悬液，1 000 r/min 4 min离心，弃上清，加0.5 ml Binding Buffer重悬细胞，加入1μl荧光标记的Aannexin V试剂，混匀后避光室温下孵育20 min。加入5μl PI混匀后避光4℃下孵育5 min，孵育后加入500 μl Binding Buffer，立即上流式细胞仪分析，激发波长Ex=488 nm; 发射波长Em=530 nm。
2.5 总抗氧化能力及氧化平衡体系酶测定
采用比色法测定总抗氧化能力（T-AOC），采用2,4-二硝基苯肼显色法检测LDH活性，硫代巴比妥酸法测定MDA含量，黄嘌呤氧化酶法测定SOD活力，二硫代二硝基苯甲酸法测定GSH-Px含量，钼酸铵法测定CAT活力。具体操作步骤参照试剂盒说明书。
2.6 统计分析
计量数据以均±s表示，采用 SPSS13. 0统计软件进行分析。多组数据间比较采用单因素方差分析 （One Way ANOVA）处理，组间两两比较采用LSD法。检验显着性水准α＝0.05。
3 结果
3.1 丹参酮ⅡA对过氧化氢所致心肌细胞损伤的细胞活力与细胞凋亡的影响与正常组比较，模型组心肌细胞活力显着降低，细胞凋亡率则显着增加；在改善细胞活力方面，丹参酮ⅡA高剂量组细胞活力较模型组显着增高，而丹参酮ⅡA中剂量、低剂量 与模型组比较无统计学差异。在改善细胞凋亡率方面，丹参酮ⅡA各剂量组细胞凋亡率均显着低于模型组，中剂量与低剂量差异无统计学意义。丹参酮ⅡA对过氧化氢所致心肌细胞损伤抗氧化能力的影响与正常对照组比较，模型组心肌细胞总抗氧化能力、SOD活性、GSH-Px活性、CAT活性显着降低，而LDH活性、MDA含量则显着增加；丹参酮ⅡA可呈剂量依赖性增加总抗氧化能力、SOD活性、GSH-Px活性、CAT活性，降低LDH活性、MDA含量。
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