SchB对UVA损伤HaCat保护作用的讨论论文
随着大气臭氧层的破坏，紫外线对人体皮肤的损伤也越来越严重，主要包括长波紫外线(UVA，320～340 nm)和中波紫外线(UVB，290～320 nm)。UVA对皮肤的损伤程度高于UVB，其会导致皮肤真皮组织中的胶原及弹力纤维降解、皮肤光敏反应发生、皮肤免疫功能降低及皮肤肿瘤形成。五味子乙素(SchB)可抑制大鼠肝脏质膜中丙二醛(MDA)的增加[4]，维持细胞在氧化损伤状态下的稳定性。在四氯化碳引起大鼠肝细胞脂质过氧化损伤的模型中，SchB可使肝细胞MDA、乳酸脱氢酶(LDH)及丙氨酸转氨酶(ALT)释放减少，肝细胞的存活率明显提高。SchB还可减轻过氧化氢(H2O2)对心肌细胞的氧化损伤，表现为MDA及LDH降低，谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性增高。但SchB在皮肤抗老化方面的研究较少。本研究旨在研究SchB是否对UVA照射后的永生化人角质形成细胞(HaCat细胞)有保护作用，并对其保护机制进行探讨。
1 材料与方法
1.1 主要仪器和试剂
NikonTS-100倒置显微镜;台式紫外线辐射仪(上海，Sigma公司);SW-CJ-2FD型双人单面净化台，苏州净化设备有限公司;MCO-AC 型CO2 细胞培养箱，SANYO公司;多功能酶标仪，Thermo Scientific公司。DMEM液体培养基为天润善大公司产品;胎牛血清(FBS)购自中国医学科学院血研所科技公司;二甲基亚砜(DMSO)考马斯亮蓝G250为FLUKA公司产品;胰酶(Trypsin)、DMSO购于GIBECO公司。SchB相对分子质量400，由天津武警后勤医学院生药学教研室陈虹教授研究室提供，体外实验用DMSO配制。
1.2 实验分组及照射方法
将盛有传代HaCat细胞的培养瓶放入5%CO2孵箱中培养，10%FBS的低糖DMEM培养，每天换液。实验设对照组(不经UVA照射)、模型组(UVA照射剂量为1、5、10、15 J/cm2)及ShcB 1~4组(UVA照射后分别加入ShcB 0.1、0.01、0.001、0.000 1 μmol/L)。UVA 波长为320～400 nm，照射距离为1 cm。倒去各组的细胞培养液，PBS洗2次，再加入适量的冷PBS覆盖，照射后加入无血清的培养液继续培养，通过检测细胞存活率来确定合适的照射强度。采用合适强度UVA处理HaCat细胞，给予不同浓度的SchB处理UVA损伤后的HaCat细胞。
1.3 噻唑蓝(MTT)实验
取对数生长期HaCat细胞，胰酶消化后制备细胞悬液，调整浓度为1.5×105个/mL，每孔100 μL的细胞悬液加入96孔板中，培养36 h后做UVA处理，每组设6个复孔。ShcB组UVA照射2 h后加入不同浓度SchB。所有研究组继续培养24 h 后，每孔加入50 μL 的MTT，37 ℃ 5%CO2孵箱培养4 h后，加DMSO 4 h，在震荡仪上震荡4 min后在酶标仪550 nm处测定光密度(OD)值，计算细胞存活率=1-(对照组OD值-模型组OD值)/对照组OD值。
1.4 氧化损伤实验
取对数生长期HaCat细胞，胰酶消化后制备细胞悬液，调整浓度为1×105个/mL，铺到10 cm的'培养皿中培养，设对照组、模型组、ShcB 1~4组，放入5%CO2孵箱中，培养36 h后，用5 J/cm2的UVA照射2 h，ShcB 1~4组给药，继续培养24 h后，取上清液酶生化法测定细胞外的GSH-Px、双氧化物歧化酶(SOD)、LDH和NO的含量。
1.5 统计学方法
用SPSS 17.0进行统计学分析。实验数据均用xˉ±s 表示，各组之间均数的比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 UVA实验照射剂量的确定对照组和1、5、10、15 J/cm2模型组HaCat细胞的存活率分别为(100.00±6.31)%、(98.10±5.78)%、(75.05±8.64)%、(66.10±5.61)%和(53.71±2.59)%，差异有统计学意义(F=18.805，P<0.01)。随UVA照射剂量增大，HaCat细胞存活率逐渐降低，预实验发现细胞存活率低于70%时，再加用SchB时受损HaCat细胞几乎不再增殖，GSH-Px、SOD、LDH、NO几乎无差别，不符合实际情况，故选择5 J/cm2作为实验照射剂量。
2.2 不同浓度SchB对UVA损伤后HaCat细胞的保护作用SchB 3组细胞存活率最高，但随SchB浓度降低，药物的保护作用减弱。
2.3 不同浓度SchB 对HaCat 细胞GSH-Px、SOD、LDH、NO 含量的影响与对照组比较，模型组的GSH-Px、SOD 活性降低，LDH、NO 含量升高(P<0.05)。与模型组比较，SchB 1~4组均能提高SOD活性，降低LDH、NO含量，除SchB 4组外，SchB 1~3组均能提高GSH-Px活性。
3 讨论
UVA 辐射可诱导细胞产生活性氧簇(ROS)。ROS攻击细胞膜上不饱和脂肪酸，发生脂质过氧化反应，产生更多的ROS，导致皮肤细胞DNA的光损伤，表现为皮肤的表皮和真皮层的损伤。SchB为五味子中的单体活性成分，其可以清除肝细胞中的自由基及脂质过氧化物，并可提高肝细胞中抗氧化物酶的表达。侯微等研究发现，SchB可以减轻H2O2造成HaCat细胞的氧化应激损伤，从而起到一定的保护作用，与本实验的结果相似。本实验通过检测皮肤的保护性指标SOD、GSH-Px的含量和损伤性指标LDH、NO的含量发现，随着SchB浓度的降低，其对HaCat 细胞保护作用越强，当浓度降到0.001 μmol/L时，保护作用最强。因此不是SchB浓度越高，保护作用就越强，0.001 μmol/L的SchB为最适浓度，过高及高低的浓度保护效果均不佳，原因有待相关试验进一步分析。
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