详谈RGD肽段连接的近红外量子点对小鼠的毒性作用论文
目前功能化的量子点(quantum dots，QDs)探针已在细胞和生物分子标记示踪、活体肿瘤成像、药物监测、信号转导和生物芯片等生物医学研究领域显示出极其重要的作用。但由于QDs核的成分为重金属(如Cd、Se等)，其生物毒性和生物安全性引起了人们的广泛关注。有研究表明：由于QDs核的重金属离子释放以及作为纳米粒的QDs具有诱导细胞产生活性氧自由基，从而对机体和细胞产生毒性作用。但另外一些研究表明：一些表面包裹有生物活性物质的功能化QDs，在体外和体内均未观察到对细胞或机体的毒性作用。已有研究证实：影响功能化QDs毒性的因素很多，包括QDs核的成分组成、粒径大小、暴露浓度、暴露时间、表面包覆材料的物理和化学性质、作用环境、给药途径和作用细胞的种类等，因而不能笼统地将功能化QDs定义为有毒或无毒，对不同类型功能化的QDs的生物毒性需要进行个体化的评价，重要的是首先要评价不同类型功能化QDs在达到医学应用目的的剂量下是无毒或有毒。近年来有研究证明：将近红外量子点(near-infrared quantum dots，NIR QDs)与RGD连接制备的NIR QD-RGD探针能与肿瘤新生血管内皮细胞表达的整合素αvβ3特异性地靶向结合，对体质量为20～25g的小鼠，每只静脉注射150～200pmol剂量的NIR QD-RGD探针能达到对体内肿瘤及肿瘤新生血管清楚的成像，对癌症的早期诊断，体内肿瘤成像和个体化治疗具有巨大的发展前景，但目前还未见NIR QD-RGD的毒性研究报道。用于临床的制剂，无论诊断和治疗，常常需要重复使用，因此重要的是要评价NIR QD-RGD在达到医学应用目的所需的剂量下重复使用时其毒性作用。本研究用发射波长为800nm 的NIR QDs(NIR QD800) 与RGD 肽段偶联，制备NIRQD800-RGD 探针，探讨200pmol剂量的NIRQD800-RGD对小鼠行静脉单次和重复注射后是否对机体和细胞产生毒性作用，为NIR QD-RGD的进一步研究和向临床应用转化提供依据。
1 材料与方法
1.1 主要试剂和仪器
QD800抗体连接试剂盒(Q22071MP，Invitrogen公司，美国)，RGD肽段(上海吉尔生化)，总蛋白定量试剂盒(A045-2)、总超氧化物歧化酶(SOD)测试盒(A001)、谷胱甘肽(GSH) 测试盒(A006-1) 和丙二醛(MDA)测试盒(A003-1) (南京建成生物工程研究所)。紫外分光光度计(DU-600，Beckman公司，美国)，透射电子显微镜(H-7500，日立公司，日本)，激光光散射仪(BI-200SM，Brookhaven公司，美国)，活体成像系统(Maestro EX IVIS，CRI 公司， 美国)， 全自动血细胞分析仪(XE2100，Sysmex公司，日本)，全自动生化分析仪(ModularDDP，Roche公司，德国)，冷冻离心机(Z233MK-2，HERMLE公司，德国)，光学显微镜(E100，尼康公司，日本)。
1.2 实验动物
SPF级雄性BALB/C小鼠33只，鼠龄6～8周，体质量17～20g，购自重庆医科大学实验动物中心，恒温恒湿条件下饲养，室温(22±2)℃，空气湿度(60±10)%，垫料、饲料和饮水均经灭菌处理，饲料和水自由摄取。所有实验操作程序均经过重庆医科大学实验动物研究所实验动物使用管理委员会批准。
1.3 QD800-RGD的制备
按照QD800抗体连接试剂盒实验手册提供的实验步骤制备QD800-RGD。①量子点活化和洗脱：浓度为10mmol·L-1的双功能SMCC溶液预热15min (37℃)后取出14μL加入1.5mL的EP管内，然后加入浓度为4μmol·L-1的QD800液125μL，均匀混合，在室温下活化反应1h后用NAP-5柱子洗脱反应样本，收集有色的洗脱液约500μL。②RGD的还原和分离：RGD 肽段粉剂溶于300 μL、pH 为7.2～7.4的PBS液中，调整到浓度为1g·L-1，然后将6.1μL浓度为1mol·L-1的DTT液加入RGD溶液中，混合均匀，室温下还原反应30min后加入20μL染料指示标记液，用NAP-5柱分离反应样本，从洗脱出的第一滴着色样本开始收集，共收集500μL。③偶联和灭活：将以上收集的2种洗脱液混合均匀、室温下偶联反应1h，然后加入浓度为10mmol·L-1的2-巯基乙醇3μL，均匀混合后在室温下灭活反应30min。④浓缩和纯化：将1mL以上偶联灭活后的样本加入2个超滤离心装置管中，每个管0.5 mL，超速离心15 min(7 000r·min-1)，收集各超滤离心膜内侧20μL的偶联样本溶液，然后用Pierce柱行色谱分离，得纯化的QD800-RGD。最后根据产品说明书提供的消光系数和测量波长算出纯化的QD800-RGD浓度，其计算公式为：A=εcl(A 为吸光度值，ε为消光系数，c为分子浓度，l为光程)。
1.4 QD800-RGD和QD800特性检测
分别各取浓度为16mmol·L-1的QD800-RGD和QD800溶液50μL，用双蒸水稀释100倍，超声震荡后分别吸取各样品悬液约50μL滴到有膜的铜网上，静置10min后用滤纸吸去多余的液体，待干后用透射电子显微镜观察QD800-RGD和QD800的分散性。然后再分别取QD800-RGD和QD800各200μL于样品池内，用超纯水稀释至6mL，密封样品池后用激光光散射仪检测QD800-RGD和QD800的流体动力学直径。
1.5 QD800-RGD 和QD800在小鼠体内分布
SPF级雄性BALB/C 小鼠9只，随机分为3组，每组3只。Ⅰ组通过尾静脉注射100μL的QD800-RGD液(含200pmol QD800)，Ⅱ组通过尾静脉注射100μL (含200pmol)QD800，Ⅲ组通过尾静脉注射100μL的PBS液。24h后断颈处死小鼠，立即解剖取出脑、心、肝、脾、肺、肾、胫骨和胃，用PBS冲洗后滤纸吸干，用Maestro EXIVIS行器官的荧光成像检测(激发光：630nm;发射光：800nm)，观察QD800-RGD和QD800在小鼠以上各器官的'分布。
1.6 各组小鼠全血细胞计数和血清生化分析
24只SPF级雄性BALB/C小鼠随机分成4组，每组6只。单次注射组小鼠在第1天通过尾静脉注射100μL的QD800-RGD (含200pmol QD800);单次注射对照组小鼠在第1 天通过尾静脉注射100μL的PBS;重复注射组小鼠分别在第1和7天通过尾静脉各注射100μL 的QD800-RGD (含200pmol的QD800);重复注射对照组小鼠分别在第1和7天通过尾静脉各注射100μL的PBS。每天观察1次小鼠的一般情况。第14天，将小鼠禁食不禁水12h后摘除眼球采血，每只小鼠取血约1.2mL，分别装入抗凝采血管和促凝采血管各约0.6mL。用全自动血细胞分析仪检测抗凝管全血中的白细胞、红细胞、血红蛋白、血小板、淋巴细胞和中性粒细胞。将促凝管中收集的血液立即离心6min (4℃、3 000r·min-1)分离得到血清，用全自动生化分析仪检测血清中总蛋白、白蛋白、白蛋白/球蛋白比值、天门冬氨酸氨基转换酶、丙氨酸氨基转换酶和血尿素氮。
1.7 各组小鼠脏器系数
24只小鼠取血后，立即脱臼处死，称体质量，然后解剖取出肝、脾、肾和肺，用滤纸吸干脏器表面的体液和血液后用电子天平称质量，小鼠的脏器系数=脏器质量(g)/体质量(g)×100%。
1.8 各组小鼠肝、脾、肾和肺组织中氧化和抗氧化指标的检测
24只小鼠的器官称质量后，立即将肝、脾、肾和肺切分为2块，将各器官的其中一块用4℃ 生理盐水冲洗3次，滤纸吸干后准确称质量，按器官质量(g)∶体积(mL)=1∶9的比例加入生理盐水，冰水浴条件下机械匀浆3min，将匀浆液低温离心10 min (4℃、3 000r·min-1)，分别各取上清液用考马斯亮蓝法检测各匀浆液的总蛋白浓度。然后用总SOD测试盒、GSH测试盒和MDA试剂盒分别测定肝、脾、肾和肺组织中的总SOD、GSH 活性和MDA含量，实验严格按测试盒说明书进行。
1.9 各组小鼠组织病理学检查
将另一块肝、脾、肾和肺组织用4%多聚甲醛固定6h后行常规石蜡包埋，切割为4μm 厚的组织切片，HE染色后采用光学显微镜观察组织病理学变化。
1.10 统计学分析
采用SPSS 18.0软件进行统计学分析。全血中的白细胞、红细胞、血红蛋白、血小板、淋巴细胞和中性粒细胞，血清中总蛋白、白蛋白、白蛋白/球蛋白比值、天门冬氨酸氨基转换酶、丙氨酸氨基转换酶和血尿素氮，器官体质量系数，总SOD、GSH活性和MDA含量均以x±s表示，组间比较采用单因素方差分析。
2 结 果
2.1 QD800-RGD和QD800特性
本实验获得的QD800-RGD浓度为1.2μmol·L-1。电子显微镜下显示：QD800-RGD 和QD800均有良好的分散性，均未发生团聚。QD800-RGD和QD800的平均流体动力学直径分别为(23.83±5.24)和(16.67±3.81)nm。
2.2 QD800-RGD和QD800在小鼠体内分布
经小鼠尾静脉注射QD800-RGD和QD800 24h后，在小鼠肝、脾和肺内可以检测到明显的QD800荧光信号存在，脑、心、肾、胫骨和胃内未见明显的QD800荧光信号，表明QD800-RGD和QD800静脉注射后在体内器官的分布相似。
2.3 各组小鼠的一般情况
各组小鼠均存活，进食、进水正常，大、小便正常，无举尾、无皮肤及毛发的颜色改变，无行动异常、无兴奋和抑制反应。
2.4 各组小鼠脏器系数
QD800-RGD和PBS分别行单次和重复静脉注射后各组小鼠的肝、脾、肾和肺的脏器系数比较差异均无统计学意义(P>0.05)
2.5 各组小鼠全血细胞计数
4组小鼠外周血中白细胞、红细胞、血红蛋白、血小板、淋巴细胞和中性粒细胞检测结果见表2。4组小鼠的各血细胞计数比较差异均无统计学意义(P>0.05)。
2.6 各组小鼠血清生化指标
4组小鼠血清生化指标检测结果见表3。各组小鼠血清中总蛋白、白蛋白、白蛋白/球蛋白比值、天门冬氨酸氨基转换酶、丙氨酸氨基转换酶和血尿素氮比较差异均无统计学意义(P>0.05)。
2.7 各组小鼠肝、脾、肾和肺中SOD、GSH 活性和MDA含量
4组小鼠肝、脾、肾和肺组织中的SOD、GSH 活性和MDA含量检测结果见表4。4组小鼠各器官的SOD、GSH 活性和MDA 含量比较差异均无统计学意义(P>0.05)。
2.8 各组小鼠组织病理学检查
HE染色结果显示：单次和重复静脉注射QD800-RGD组小鼠肝、脾、肾和肺组织均无坏死，细胞形态、数量及分布与对照组比较无明显差异。
3 讨 论
本研究采用的QD800为核-壳纳米结构，是以CdSeTe为核，ZnS为壳，外面连接末端带氨基的聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)为外涂层。影响QDs毒性的因素很多，不同类型功能化QDs的毒性作用差异很大。有研究报道：QDs通过静脉进入体内后首先与血液中的成分相互作用，引起多种炎症和血液因子(如白细胞、血小板和红细胞等) 的改变。以往的研究证明：150～200pmol剂量的NIR QD-RGD 对体质量为20～25g的小鼠行静脉注射能达到对肿瘤的可视化成像。本研究对体质量为17～20g的每只小鼠行单次和重复静脉注射200pmol的QD800-RGD，每次注射剂量均超过QD800-RGD达到医学应用目的的最大剂量，结果表明：QD800-RGD单次和重复静脉注射14d后均未对小鼠产生血液学毒性作用。
目前研究认为：QDs产生毒性作用的机制是量子点释放的重金属离子(如Cd2+、Se2- 等)和QDs进入体内后可诱导细胞产生活性氧自由基，从而对细胞产生毒性作用。本实验结果和以往的研究均证明：QD800-RGD静脉注射后主要分布于肝、脾和肺，由于肾是体内排泄器官，因此本研究重点观察QD800-RGD进入体内后对肝、脾、肺和肾的毒性作用。血清中的蛋白(如总蛋白、白蛋白)和一些独特的酶(天门冬氨酸氢基转换酶和丙氨酸氨基转换酶)及血尿素氮的水平是反映肝、肾功能的重要指标，当肝、肾器官发生炎症或损伤时以上指标会发生显著性变化。本研究结果表明：小鼠单次和重复静脉注射200pmol的QD800-RGD后未产生肝肾功能的损害。
活性氧自由基与细胞的增殖、分化和凋亡等多种生理及病理现象密切相关，活性氧自由基的增多可引起脂质过氧化损伤，引起细胞膜破损，进而导致细胞凋亡或死亡。MDA 是细胞发生脂质过氧化反应中最具代表性的产物，其含量的多少可代表机体脂质过氧化的速率和强度，同时细胞内活性氧自由基的产生与清除是由多种酶组成的氧化还原系统完成的，SOD和GSH 是细胞内清除活性氧自由基的2种关键酶，因此MDA、SOD和GSH 常被作为研究机体氧化应激和抗氧化防御的指标。本研究结果表明：单次和重复静脉注射200pmol的QD800-RGD 未导致小鼠肝、脾、肾和肺组织中的SOD、GSH 活性和MDA 含量的显著改变;同时组织病理学检查也证明：单次和重复静脉注射QD800-RGD后也未导致小鼠肝、脾、肾和肺的细胞损伤或坏死。
综上所述，功能化的QDs种类多样，其毒性作用差异很大，对不同种类功能化的QDs的生物毒性需要进行个体化的评价。本实验首次证明：QD800-RGD在达到医学成像所需的剂量下重复静脉注射，在小鼠体内未导致明显的急性毒性作用，为QD800-RGD的进一步研究和向临床应用转化提供了重要依据。需要进一步研究的问题是：由于QDs进入体内的毒性与剂量有密切关系，需要进一步研究确定机体毒性与QD800-RGD的剂量的依赖性关系;QD800-RGD进入体内后的长期毒性作用以及具体代谢过程。
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