寄生线虫遗传多样性的分子研究成果探析论文

时间：2021-04-15 15:02:29 论文我要投稿

　　生物多样性包括遗传多样性、物种多样性、生态系统多样性和景观多样性。在生物多样性这四个层次中，遗传多样性是核心内容和生物进化的基础。遗传多样性是指同一物种内不同种群间或同一种群内不同个体间的遗传变异的总和[1], 在种群间或种群内主要表现为分子、细胞和个体三个水平上的遗传变异[2]. 通常来说 , 遗传变异程度的高低是反映遗传多样性大小的最直接表达形式。在自然界中，种群是生物进化的基本单位，种群遗传结构的差异也反映着遗传多样性的程度，所以遗传变异的大小和种群遗传结构的差异同时决定着一个物种的进化潜力和对不良环境的抵抗能力[3].

寄生线虫遗传多样性的分子研究成果探析论文

　　遗传多样性的研究有着重要的价值，可以为物种的进化提供理论支持，加深人们对生物起源的认识，同时为保护现有资源提供背景资料[4]. 对于寄生线虫来说，每年由寄生线虫引起的疾病，给家畜的健康和畜牧业的发展带来严重的危害，这使得人们的研究不断深入，从最初对寄生线虫的形态学、系统分类学和生态学特征等方面的描述，逐渐发展到遗传特性、分子进化以及基因功能等方面的研究[ 5].

　　寄生线虫种群遗传学的研究可以在种群间或种群内进行，遗传多样性依赖于碱基的突变率、种群的有效大小和种群的迁移率等[6]. 遗传多样性的研究对了解寄生线虫的流行方式、抗药性等位基因的扩散以及疾病的防控有着重要的意义。

　　1寄生线虫遗传多样性的分子研究方法

　　遗传多样性的研究方法从传统的形态学标记、染色体标记和生化标记逐步发展到DNA分子标记。DNA是遗传物质的载体 , 遗传信息就是DNA的碱基排序，直接对DNA碱基序列的分析和比较是揭示遗传多样性的最理想方法。与其他标记相比， DNA分子标记不受发育阶段和组织特异性的影响，多态信息含量丰富，现已被广泛应用到系统发育、基因定位和遗传育种等研究中[7]. 此外 , DNA分子标记应用于研究种群遗传多样性时，不需要大量的表型遗传基础作为背景资料，为加快寄生线虫的分子生物学研究、诊断分析和潜在疫苗的特征描述提供了技术保障。

　　1.1 限制性片段长度多态性（ restriction fragmentlength polymorphism, RFLP） RFLP 标记是以分子杂交为核心的第1代分子标记技术。其基本原理是基因组DNA上的特定核苷酸序列可被限制性内切酶识别并切割，然后与探针结合进行Southern杂交，通过放射显影的方法观察所获得的特异性RFLP图谱[8]. 这种分子标记的出现 , 使得种群遗传学的发展向前跨越了一大步，但是同位素标记的使用存在一定的放射性污染，对于不同发育阶段的个体差异分析，敏感性不高。随着PCR技术的建立， RFLP常与PCR技术相结合应用于种群遗传多样性的分析中，既克服了上述方法的局限性，也省去了酶切和杂交等繁琐的操作过程，并且仅需少量的DNA模板[9]. PCR-RFLP的.原理是将扩增的PCR产物使用特异性的限制性内切酶切割成大小不同的片段，再利用凝胶电泳分辨其差异性。

　　1.2 随机扩增多态性 DNA （ random amplifiedpolymorphic DNA, RAPD） RAPD 技术最早出现于20世纪90年代，是以PCR为核心的第2代分子标记技术。使用该分子标记时不需要了解研究对象的DNA序列信息 , 利用10个核苷酸的随机寡核苷酸序列作为引物，对基因组DNA进行PCR扩增，根据凝胶电泳显示的若干大小不一片段分析该物种的多态性[ 10,11]. 应用 RAPD 分子标记时所需 DNA 的量少 ,操作简易，检测速度快，可以检测出RFLP标记不能检测的重复序列区，填补RFLP图谱的空缺，但是该分子标记重复性和特异性比较差[12].

　　1.3 聚合酶链式反应-单链构象多态性（polymerasechain reaction-single strand conformation polymorphism,PCR-SSCP） PCR-SSCP 标记是将 PCR 和 DNA 单链构象多态性结合的第2代分子标记技术。其原理是将扩增得到的 DNA 双链产物变性处理成单链的DNA, 在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中 , 根据电泳迁移率的不同，观察单链DNA构象的差异，反映出物种的多态性[ 13]. 传统的 SSCP 分析采用平板凝胶电泳，这不仅费时费力，还不能满足大量筛选突变基因的需要。有研究者将毛细管电泳与SSCP结合替代了平板凝胶电泳[14], CE-SSCP标记具有分离效率高、分析速度快、样品用量少等特点， 20世纪80年代， CE-SSCP标记得到广泛应用。

　　1.4 扩增性长度片段多态性（ amplified fragmentlength polymorphism, AFLP） AFLP标记也是第2代分子标记技术的一种，与RFLP标记不同的是该标记需要两种限制性内切酶切割基因组DNA, 酶切片段的5′端在T4连接酶的作用下与带有两种内切酶黏性末端的接头序列连接，接头序列是由核心序列和内切酶识别序列两部分组成，接头序列与引物3′端选择性碱基识别，对特异性片段进行预扩增和选择性扩增，在变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳上检测PCR产物，寻找多态性片段[15]. AFLP 标记兼具了 RFLP和RAPD两种标记的优点，但是操作比较复杂，花费较高。

　　1.5 微卫星DNA （microsatellite DNA, SSR）微卫星DNA 又被称为简单重复序列（ simple sequencerepeat, SSR）或者短串联重复序列（ short tandemrepeat, STR） , 广泛且随机地分布在真核生物的基因组中[16], 是由1~6个核苷酸为重复单元组成的串联重复序列。微卫星DNA呈现出的高度多态性以自身重复单位数的差异为基础，在DNA复制过程中出现滑链现象，使重复序列之间发生了插入和缺失等变化，出现了大量的不同的等位基因从而引起了微卫星DNA的高度多态性[17,18]. 微卫星DNA 是由核心序列与其两端的侧翼序列组成的，根据两端保守的侧翼序列设计PCR反应的引物，扩增出微卫星片段，用于遗传多样性的分析。目前，微卫星DNA被广泛应用于种群遗传结构分析、构建遗传图谱、亲子鉴定和QTL定位等研究中。

　　1.6 线粒体DNA （mitochondrial DNA）寄生线虫的线粒体基因组与后生动物的线粒体基因组相似，也呈环形，基因组大小在12~26 kb. 目前大约有110 种线虫的线粒体基因组全部完成测序和分析 .线粒体基因组包括12~13个编码基因，分别是烟酰胺脱氢酶亚单位1~6和4L基因、细胞色素氧化酶亚单位1~3和b基因、 ATP酶亚单位6或8基因 [除旋毛虫（Trichinella spiralis）外，大部分线虫的线粒体基因组不包括ATP酶亚单位8基因], 还包括tRNA基因和rRNA基因[19]. 线粒体基因组独立存在于细胞核外，与核基因组相比进化速率快，有母系遗传特征并且能够稳定遗传[20], 常被应用在种群遗传学的研究中，尤其是相对保守的cox1和nad4基因应用广泛。

　　1.7 DNA 分子标记方法特征的比较 DNA 分子标记可以分为两大类型， I型是与分子标记相关联的基因的功能是已知的， II型是与分子标记相关联的基因功能是未知的[21]. DNA分子标记被广泛应用于种群的遗传学分析中，每种标记都有自身的优点和局限性，常用的分子标记特点见表1.

　　2寄生线虫遗传多样性的研究现状

　　2.1 捻转血矛线虫（ Haemonchus contortus）线粒体DNA属于核外基因，并且具有进化速率快、母系遗传等优点，因此常被选作遗传标记应用于捻转血矛线虫遗传多样性的研究中。国内外均有报道，以线粒体nad4基因作为遗传标记，对寄生在牛羊体内的捻转血矛线虫的种群遗传结构进行分析，包括美国、希腊、德国、瑞典、澳大利亚、印度尼西亚、柬埔寨、马来西亚、也门、巴西、中国和巴基斯坦等地区[22-27]. 这些研究均表明 , 捻转血矛线虫的遗传变异大部分来自种群内部。其次，从全球范围来看，来自距离相近的国家或同域的种群，种群间基因流动高，导致种群间遗传分化程度不高；而对于不同地理起源的种群来说，受地理隔离的影响，种群间基因流动有一定的阻碍，使得种群间的遗传分化程度相对较高。而以同样基因作为遗传标记分析寄生在野生动物体内的捻转血矛线虫的种群遗传结构时，发现种群内部也表现出较高的遗传变异[28].

　　国外研究者对捻转血矛线虫的微卫星DNA的结构特点也进行了研究，结果发现捻转血矛线虫的微卫星位点不属于完美型，但捻转血矛线虫的微卫星标记的多态性比较丰富，可作为遗传标记用于种群遗传结构分析[29,30]. 利用8个微卫星位点分析捻转血矛线虫成虫和3期幼虫的遗传多样性，结果表明，在对大量的幼虫DNA样品进行遗传学研究以及实验室株和野生株之间的遗传关系分析上，微卫星标记是一种简便而又快速的手段[31]. 以11个微卫星位点作为遗传标记，分析澳大利亚不同气候和地理位置的捻转血矛线虫的种群遗传结构，结果表明来自澳大利亚不同地理位置的种群表现出明显的遗传差异，同时也观察到虫体表型上的差异[32].

　　2.2 毛圆线虫 Grant等[33]在1994年借助RFLP分子杂交技术，使用简单非重复性的探针对蛇形毛圆线虫（Trichostrongylus colubriformis）的种群间和种群内的遗传关系进行了分析，同时比较了蛇形毛圆线虫的实验室株和野生株之间的遗传差异。研究发现实验室株的多态性并不少于野生株，说明在相对规模小的种群内也能维持足够的多态性。PCR-RFLP 标记也可应用于寄生线虫种类的鉴定，利用该技术鉴别来自山羊、绵羊、牛和猪体内的 24 种毛圆线虫 , 对核糖体 DNA 内转录间隔区（ITS）的PCR-RFLP分析结果表明 , ITS-1和ITS-2是鉴别寄生线虫种类的特异性遗传标记[34].以RAPD作为种类特异性的标记对毛圆线虫进行鉴定，但是这些寄生线虫的种内高度变异使得鉴定结果不可靠，需要同时结合生态学和形态学一起进行种类上的鉴别[35].

　　2.3 肺线虫利用线粒体 cox1 基因分析瑞典胎生肺线虫（Dictyocaulus viviparus）的种群遗传结构，数据分析后共得到12个单倍体，单倍型多态性和核苷酸多态性分别是0.160和0.002, 不同地理起源的12个单倍体聚类分析没有发现明显的遗传结构 , 分析结果表明牛肺线虫的种群内部遗传差异较小，并且种群间的基因流动也较低[36].利用AFLP标记对来自瑞典的胎生肺线虫的8个野生株和1个实验室株的种群遗传结构进行分析，结果显示种群内的杂合体较少，这可能与种群的突变率和迁移率保持平衡有关。从AFLP图谱上可发现实验室株与野生株的种群遗传结构有所不同。将野生株和实验室株作为一个整体时，分析结果显示有50%的变异发生在种群内部。而8个野生株单独分析时，发现有60%的变异发生在种群内部[37].应用mtDNA （cox3、 nad5、 rrnL、 trna）和AFLP两种分子标记对同样的8个野生株和1个实验室株进行种群遗传结构研究，发现这8个野生株中至少存在3个亚种群结构，其中有1个占主导地位。在这个占主导地位的种群中又分化出两个较小的遗传组群，该分析结果意味着这些牛肺线虫有着多重的来源[38].

　　2.4 环背带线虫（Teladorsagia circumcincta）使用线粒体nad4基因研究来自法国和摩洛哥的11个环背带线虫种群的遗传结构，结果显示所有的种群都呈现高度的核苷酸多态性，在小规模的地理范围内（小于200 km）种群没有发生遗传亚分化 , 在大规模的地理范围内FST值比较显着，但种群之间的遗传差异不明显[39].由于环背带线虫的种群遗传学信息较少，限制了对药物抗药性的研究， Grillo等[40]在2006年通过环背带线虫的EST数据库筛选了7个多态性丰富、稳定性好、扩增效率高的微卫星位点用于种群遗传学的研究。以5对微卫星标记分析环背带线虫的9个野生株和3个实验室株的种群内和种群间的遗传关系，结果显示所有的种群均在种群内部表现出了高度的遗传变异。对于来自英国不同地理起源的野生株和实验室株的种群没有检测到遗传差异；而来自法国野生株的4个种群和来自新西兰实验室株的1个种群在种群间表现出明显的遗传差异。最后分析结果表明寄生在山羊体内的环背带线虫不是单一的虫种，有可能存在隐藏种[41].

　　2.5 钩虫将 PCR-SSCP 标记与 DNA 测序相结合研究犬钩虫（Ancylostoma caninum）、十二指肠钩虫（ Ancylostoma duodenale）和美洲钩虫（ Necatoramericanus）的群体遗传结构 , 结果表明在犬钩虫和十二指肠钩虫中存在着亚种结构，来自中国和多哥的美洲钩虫有4个不同的核苷酸固定位点变异，暗示美洲钩虫是一个复杂的种群，这些发现说明钩虫的种群遗传学研究有着重要的流行病学意义[42 ].以线粒体cox1基因为遗传标记，对寄生在人、狗和猫体内的钩虫的遗传特征进行研究，系统发育分析发现不同宿主体内的钩虫分成两个聚类群，其中一簇包括寄生在人体内的3个隔离株，另一簇由寄生在人和动物体内的19个隔离株组成。进一步分析发现两个聚类群的钩虫的核苷酸序列有5个碱基的差异，这些发现意味着不同宿主体内的钩虫可能存在相似的单倍型[43]. 以同样的遗传标记对寄生在澳洲海狮（Neophoca cinerea）体内的钩虫进行种群遗传结构分析，研究发现种群间基因流动高，遗传分化程度较低，反驳了由于地理隔离阻碍了钩虫基因流动的假设[44].

　　2.6 鼠类圆线虫利用PCR-RFLP标记对来自英国和德国的鼠类圆线虫（Strongyloides ratti）（寄生在野生鼠体内）种群遗传结构进行分析，分析表明来自宿主体内不同个体间的差异为73.3%, 同一采样地点不同种群间的差异为25.3%, 不同采样地点之间的样品遗传差异很小，为1.4%, 得到的数据说明鼠类圆线虫的种群间存在着一定的基因流[45].

　　2.7 其它线虫 Dame 等[46 ]在1992年应用线粒体标记分析奥斯特线虫（Ostertagia ostertagi）的种群遗传多样性，发现来自不同地理位置的种群间存在很高的基因流。利用RAPD标记技术，选择10条随机性引物扩增异小杆线虫（Heterorhabditis）的基因组DNA,分析噬菌异小杆线虫（Heterorhabditis bacteriophora）（HP88 和E1），夏威夷异小杆线虫（H. hawaiiensis）（ MG-13） , H. hepialius （ Bodega Bay） , H. indicus（EMS-13和Coimbatore），大异小杆线虫（H. megidis）（HSH2和HO1）， H. zealandica和H. marelatus （OH10）等7种异小杆线虫和不同隔离株之间的遗传相似度及差异关系 . H. hawaiiensis MG-13、 H. indicus和H. zealandica这3种线虫来自哥伦比亚 , EMS-13隔离株来自埃及 , H . hepialius 来自加利福尼亚 ,H. marelatus来自美国 . 结果表明同一种个体间平均相似百分比为96.25%, 比较异小杆线虫的3个种时，发现隔离株之间的平均相似百分比为83.8%,不同种之间的平均相似百分比为31.3%[47].

　　应用PCR-SSCP标记和对线粒体cox1基因的部分片段测序两种方法，有学者分析了来自欧洲和亚洲不同地理起源，寄生在猫、狗和狐狸体内的结膜吸允线虫（Thelazia callipaeda）的种群遗传结构。对欧洲37个个体（寄生在狗、狐狸和猫体内）的cox1基因序列进行分析，发现有6个核苷酸位点没有发生突变。而对亚洲的13个个体（寄生在狗体内）的cox1基因序列进行分析 , 发现这6个核苷酸位点中5个位点发生了G→A转换， 1个位点发生了C→T转换。 PCR-SSCP标记的分析结果与线粒体cox1基因测序分析结果一致，说明PCR-SSCP对于结膜吸允线虫的种群遗传学研究是一个很好的分子遗传标记[48].

　　利用PCR-SSCP标记分析寄生在有袋类和啮齿类动物体内的毛细线虫（Capillaria sensulato）的种群遗传结构，结果表明来自同一宿主体内的毛细线虫没有表现出明显的遗传差异，并且在同一宿主体内此类线虫会寄生在1~3个不同的组织器官中，但是来自不同宿主体内的毛细线虫则存在较明显的遗传差异，提示可能由寄生宿主种类的特异性引起毛细线虫的种群遗传差异[49].

　　3结语

　　随着分子生物学技术突飞猛进的发展，对寄生线虫的分子分类学、分子进化学和种群遗传学等方面取得了一些研究进展，但对于寄生线虫这个庞大的生物群体而言还存在很多的科学空白。近些年来，国内开展了关于捻转血矛线虫[26]、旋毛虫[50]、美洲钩虫[51]和弓首蛔虫（Toxocara）[52]等寄生线虫种群遗传学的研究，这些研究将为进一步了解寄生线虫的种群遗传学特征提供良好的理论支持。分子遗传标记技术的发展对寄生线虫新虫种的分子鉴定和系统进化的研究起到了巨大的推动作用。然而，对于大多数寄生线虫而言，基因组和遗传进化信息尚且未知，这些资料的匮乏使得对寄生线虫的宿主群的形成过程、宿主的防御和选择压力以及寄生虫药物抗药性形成的研究捉襟见肘，不断丰富寄生线虫在基因组、转录组、蛋白组以及代谢组等方面的资料，将会对研究其分子分类学、群体遗传学、分子流行病学和寄生虫病的防治提供重要的帮助。

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